Le strategie di stabilizzazione e normalizzazione delle urine favoriscono un'analisi imparziale del contenuto di EV urinari

Scientific Reports volume 12, numero articolo: 17663 (2022) Citare questo articolo

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L'urina rappresenta una fonte ideale di marcatori diagnostici non invasivi. Alcuni problemi intrinseci e metodologici pongono ancora ostacoli al suo pieno potenziale come substrato per biopsia liquida. A differenza del sangue, la concentrazione delle urine varia in base alla nutrizione, all’idratazione e ai fattori ambientali. L'urina è arricchita con EV dal tratto urinario-genitale, mentre la sua conservazione, purificazione e normalizzazione può introdurre distorsioni nell'analisi dei sottoinsiemi di EV nei confronti inter e intra-individuali. Il presente studio ha valutato i metodi che riducono tali bias come la conservazione appropriata e fattibile delle urine, il metodo ottimale di purificazione degli EV in un unico passaggio per il recupero di proteine ​​e RNA da piccoli volumi di urina e un metodo di normalizzazione per l'analisi quantitativa degli RNA EV delle urine. Ultracentrifugazione, precipitazione chimica e immunoaffinità sono state utilizzate per isolare i veicoli elettrici dall'urina di donatori sani conservata congelata o a temperatura ambiente per un massimo di 6 mesi. Diversi parametri biochimici ed EV delle urine, inclusi il conteggio delle particelle e il contenuto proteico, sono stati confrontati tra i campioni di urina. A questo scopo sono state eseguite l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) e la valutazione delle proteine ​​mediante saggi BCA, ELISA e WB. Queste misurazioni sono state correlate con l'abbondanza relativa di mRNA e miRNA EV selezionati valutati mediante RT-PCR e classificati in base alla capacità di riflettere e correggere le variazioni del contenuto di EV nei campioni longitudinali di urina. Tutti i metodi di purificazione hanno consentito il recupero e l'analisi a valle degli EV da appena 1 ml di urina. I nostri risultati evidenziano la stabilità a lungo termine degli RNA EV dopo la conservazione delle urine a temperatura ambiente, nonché un’eccellente correlazione del contenuto di EV nelle urine con alcune caratteristiche biochimiche misurate di routine, come le proteine ​​totali urinarie e l’albumina, ma non la creatinina più convenzionalmente utilizzata per la normalizzazione delle urine. La valutazione comparativa di mRNA e miRNA negli isolati di EV ha rivelato RNA specifici, in particolare RNY4 e un piccolo pannello di miRNA, i cui livelli riflettevano bene la variazione di EV inter-campione e quindi utili come possibili normalizzatori post-analitici del contenuto di RNA di EV. Descriviamo alcune soluzioni realistiche per l'elaborazione e la normalizzazione delle urine per una lettura imparziale degli studi sui biomarcatori di EV e per il campionamento e la diagnostica clinica di routine, fornendo l'input per la progettazione di studi di validazione più ampi che utilizzano gli EV delle urine come biomarcatori per particolari condizioni e malattie.

L’urina è una fonte attraente e utilizzabile di marcatori diagnostici potenzialmente preziosi per una serie di condizioni cliniche, in particolare quelle che colpiscono il tratto urogenitale come malattie o lesioni renali e tumori urogenitali. Inoltre, i biomarcatori urinari hanno mostrato un potenziale anche per patologie non urologiche1,2 come altri tumori (es. cancro al seno o ai polmoni), disturbi metabolici ed endocrini (es. diabete), condizioni infiammatorie (es. aterosclerosi e osteoartrite) e persino malattie neurodegenerative o neuropsichiatriche. malattie. L'uso dei test delle urine per diagnosticare le malattie è una pratica antica (ad esempio la rilevazione del glucosio in soggetti diabetici assaggiandolo o attirando le formiche, oppure la rilevazione dell'albumina come indicatore di una malattia renale mediante un “test della schiuma”) ed è rimasta una componente fondamentale della medicina investigativa nel corso del XX e dell’inizio del XXI secolo3. Con l'avvento delle moderne tecniche omiche, vengono rivelati una miriade di componenti dell'urina le cui alterazioni quantitative e qualitative dovrebbero avere valore diagnostico e predittivo in ambito clinico.

Paradossalmente, l’urina è ancora poco studiata come fonte totalmente non invasiva di biomarcatori liquidi che possono essere utilizzati longitudinalmente per la diagnosi e il monitoraggio. Questo paradosso è dovuto alle particolari caratteristiche di questo biofluido e agli ostacoli metodologici che ancora interferiscono con il passaggio dei candidati biomarcatori alla prerogativa quantitativa della validazione e dell'implementazione dei test diagnostici.